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碱性磷酸酶(AP)也称碱性磷酸酯酶(EC 3.1.3.1)，可以在碱性条件下催化磷酸酯键的水解。哺乳动物中，肝脏、胆管、肾脏、骨头和胎盘中的碱性磷酸酶活性比较高。常见的碱性磷酸酶包括肠道碱性磷酸酶(ALPI)、非组织特异性碱性磷酸酶(ALPL)和胎盘碱性磷酸酶(PLAP)。常见的小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)被广泛用于二抗等的标记最终用于蛋白和核酸等的检测，也常用于DNA或RNA 5'和3'末端的去磷酸化(去单磷酸化)，特别是质粒的5'末端去磷酸化以避免质粒自连等。

干细胞，如iPS中，碱性磷酸酶的活性很高，常被用作iPS成功诱导的标志。另外，分化的结肠癌细胞中碱性磷酸酶的活性也会显著升高，被当作结肠癌细胞分化程度定性和定量的指标。此外，血清中碱性磷酸酯酶的升高，被称作高碱性磷酸酶血症，被认为和恶性胆管阻塞、原发性胆管硬化、原发性硬化胆管炎、肝淋巴瘤和肝肉瘤等肝胆疾病密切相关。血清中碱性磷酸酶活性升高还和骨头生成密切相关，因为碱性磷酸酶是成骨细胞的副产物。血清中碱性磷酸酶活性过低也和一些疾病相关。儿童和孕妇血清中的碱性磷酸酶活性较普通人高一些。血清中碱性磷酸酶活性范围在20～140U/L。除胎盘碱性磷酸酶以外，其它的内源性碱性磷酸酶加热后易失活。

• 如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时必须注意精确计时。此时推荐采用孵育30分钟等较长的时间，以减小操作过程中的时间误差。同时如果样品中酶活性较高，则可以预先适当稀释样品。
  
• 样品溶液中须避免出现EDTA、氟离子、柠檬酸盐等碱性磷酸酶的抑制剂。
  
• 检测缓冲液和p-nitrophenol溶液对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。反应终止液有腐蚀性，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或腐蚀其他物品。
  
• 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 试剂准备：将所有试剂取出，恢复至室温使用。
  
  • 显色底物溶液：对于100T包装，请取一管显色底物，溶解于2.5mL的检测缓冲液中(可先用1mL检测缓冲液进行溶解，充分溶解和混匀后，转移至15mL离心管，再加入1.5mL检测缓冲液)，充分溶解和混匀，冰上放置。对于500T包装，请取一管显色底物，溶解于5mL的检测缓冲液中(可先用2mL检测缓冲液进行溶解，充分溶解和混匀后，转移至15mL离心管，再加入3mL检测缓冲液)，充分溶解和混匀，冰上放置。新鲜配制的显色底物溶液需在6小时内使用。
    
  • 标准品工作液：取10μL p-nitrophenol溶液(10mM)，用检测缓冲液稀释至0.2mL，最终浓度为0.5mM。
• 样品准备：
  
  • 细胞或组织裂解液的准备：采用适当细胞或组织裂解液裂解细胞或组织，建议使用Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)裂解相关样品。如果有必要需进行适当匀浆，随后离心取上清，用于碱性磷酸酶的检测。
    注意：裂解液中不能含有磷酸酶抑制剂。样品可以-80℃冻存，但需避免反复冻融。
    
  • 血浆、血清和尿液的准备：血浆和血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。血浆制备时不能用含EDTA和柠檬酸盐的抗凝管。尿液通常也可以直接用于测定。上述样品可以-80℃冻存，但需避免反复冻融。
    
  • 样品的稀释：如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释，也可以采用试剂盒中的检测
    缓冲液进行稀释。如果使用试剂盒中提供的检测缓冲液进行稀释，需注意保留足够的检测缓冲液用于试剂盒的检测过程。
• 参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量分别为4、8、16、24、32和40μL，样品通常可以直接加50μL。如果样品中的碱性磷酸酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。
  

  成分	空白对照(Blank)	标准品(Standard)	样品(Sample)
  检测缓冲液	50μL	(100-x)μL	(50-y)μl
  显色底物	50μL	－	50μL
  样品	－	－	yμl
  标准品工作液	－	xμl	－

• 用枪头轻轻吹打混匀，也可借助摇床进行混匀。
  
• 37℃孵育5～10分钟。(说明：待测样品中碱性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至30分钟)
  
• 每孔加入100μL反应终止液终止反应。此时，标准品或有碱性磷酸酶活性的孔会呈现不同深浅的黄色。
  
• 在405nm测定吸光度。如果不能测定405nm，也可以在400～415nm范围内检测吸光度。如果不能立即测定，可以在数小时内完成测定，所显现的黄色在数小时内稳定。
  
• 碱性磷酸酶活性单位的定义：在pH9.8的diethanolamine(DEA)缓冲液中，37℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，也被称作一个DEA酶活力单位。在pH9.6的甘氨酸缓冲液中，25℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，也被称作一个Glycine酶活力单位。一个Glycine酶活力单位约相当于3个DEA酶活力单位。本试剂盒测定的是DEA酶活力单位。
  
• 根据酶活性定义，计算出样品中的碱性磷酸酶活性。